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1.2.9 统计学方法 pVS85BG疫苗免疫组与各对照组的细胞因子和脏器结核菌落数比较采用单向方差分析。两两之间的均数比较采用q检验。分析工具为SPSS10.0系统。
2 结果
2.1 表达结核菌Ag85B与GST融合蛋白表达载体的构建及鉴定 该质粒转化后，经蓝白菌斑及卡那霉素抗性筛选，均出现阳性克隆。质粒的酶切鉴定，电泳结果表明，经相应酶切割后电泳分析的结果与设计插入的目的基因片段大小一致。见图2。
DNA测序分析的结果显示，在Ag85B和GST基因之间，加入了Xba I的酶切序列TCT AGA，因此，在连接部位表达了相应的Ser-Arg 2个aa。与设计相符合。对比文献中的序列［6，7］和我们测序分析的结果，Ag85B和GST基因序列与文献报道完全一致。
图2 PCR产物及表达载体及其酶切电泳分析结果
M： DNA marker；1、结核菌ag85b的PCR产物；2、经酶切的ag85b的PCR产物；3、gst的 PCR产物；4、经酶切的gst的PCR产物；5、pVAX1的酶切回收产物；6、为pVS85BG质粒；7、质粒pVS85BG经Xba Ⅰ和Hind Ⅲ产物；8、质粒pVS85BG经Xba Ⅰ和Pme I酶切产物
2.2 结核DNA疫苗的含量及纯度 提取的pVS85BG疫苗、pVAX1和pIL2S用紫外分光光度计测得的OD260/OD280的比值为1.787、1.842和1.754，表明纯度达到要求。3种质粒的浓度分别为1675.6、1.234和1.356μg/ml，免疫时均稀释至1000μg/ml使用。
2.3 免疫组及对照组小鼠的培养上清的细胞因子含量对比 pVS85BG免疫组的C57BL/6小鼠血清中的平均hIL-2与BCG免疫对照组、pIL2S、pVAX1和PBS等3个阴性对照组的平均hIL-2含量差异无显著性。其脾淋巴细胞培养上清的mIL-2和mIFN-γ的平均含量与BCG阳性对照组的平均浓度差异无显著性，而显著高于pIL2s、pVAX1和PBS等3个阴性对照组的平均浓度（P<0.001）。培养上清中的mIL-6和mIL-10的平均浓度在5个组之间差异无显著性。见表1。
表1 结核DNA疫苗免疫后脾细胞培养上清细胞因子含量对比 （x±s）
注：*与pVS85BG及BCG免疫组比较，差异均有非常显著性（P<0.001）。其余两组间比较，均差异无显著性
2.4 免疫组和对照组小鼠的脾、肝和肺的结核菌落数对比 pVS85BG免疫C57BL/6小鼠的脾、肝和肺组织培养的菌落均数均显著低于阴性或者空白对照组的结核菌菌落数，而显著高于BCG免疫组的相应器官的细菌菌落数(P<0.001)。各组小鼠的肝、肺和脾结核菌菌落均数资料未列出，其对数值见表2。
表2 结核DNA疫苗及对照组免疫C57BL/6小鼠的
从表2中可以看出，结核DNA疫苗pVS85BG免疫的C57BL/6小鼠的脾、肝和肺淋巴细胞载量的对数值比阴性对照组（pIL2S、pVAX1和PBS）均下降0.3个对数单位（log10）。而BCG免疫对照组的相应器官的结核菌载量分别下降0.8、0.6和0.7 个log10对数单位。
各组动物的脾、肝和肺的结核菌生长情况见图3。
图3 各组小鼠脾脏悬液结核菌生长情况
DNA疫苗pVS85BG(A)和阳性对照BCG（B）免疫，H37Rv攻击后15天脾脏悬液培养H37Rv结果，斜面上菌落稀少。仅表达hIL-2信号肽的载体（pIL2S）(C)、pVAX1（D）和PBS(E)注射C57BL/6小鼠后，，可见L-J斜面上菌落较小且密布
3 讨论
Wolff等首次报道注射编码β-半乳糖苷酶的裸露质粒DNA到肌细胞，导致基因转移到肌细胞，在核内转录，并合成该酶［12］。Tang等证实注射质粒可诱发免疫应答［13］。Silva等首先开始结核病DNA疫苗的研究［14］。他们用麻风分枝杆菌（M leprae）hsp65（heat shock protein）基因转染巨噬细胞系给同种小鼠免疫后，能保护这些小鼠抵抗静脉注射结核菌H37Rv或BCG感染。
Ag85复合群（Ag85 complex）中有Ag85A、Ag85B和Ag85C三个成员。 Huygen等用编码分泌型(含信号序列)或非分泌型(成熟型)Ag85A(30～32kDa霉醇基转移酶)的质粒载体免疫小鼠，在肌注编码分泌型Ag85A的质粒之后，小鼠显示出广泛的免疫应答迹象，如淋巴细胞增多、体液应答增强、IFN-γ和IL-2分泌，以及细胞毒性T细胞(CTL)比例上升等，并且可保护小鼠抵御临床分离的结核菌强毒株CSU37感染，而成熟型Ag85A DNA质粒的保护作用较弱，因此，分泌型Ag85A可作为结核病DNA疫苗的候选目的抗原［15］。Lozes和Montgomery证明，Ag85B质粒DNA在不同小鼠可产生不同的免疫效果，对C57BL／6小鼠具有与Ag85A类似的免疫效果，而对BALB/c小鼠却无效［16，17］。
表达Ag85B或MPT64的疫苗与表达GM-CSF的载体联合免疫可以增强T细胞免疫近2倍，但对处于感染期的保护作用增加不明显［18］。Briton等报告表达IL-2及表达Ag85B或MPT64的DNA疫苗联合免疫可增加淋巴细胞数量，CD4+和CD8+细胞分泌IFN-γ，但增强保护力的作用属中等［19］。
不同DNA载体表达的亚单位疫苗单独免疫时效果不很好，联合免疫时可以产生更好的保护效果，如降低CFU计数，感染后的生存延长等［19］。具有高免疫力的质粒简单的混合可能会引起抗原竞争。但构建表达杂交基因可解决上述问题。生产表达多种蛋白的基因疫苗从经济学角度讲也是实惠的。Corixa公司的Reed研发的Mtb72F DNA疫苗（表达结核菌Mtb39和32kDa丝氨酸蛋白酶）产生了令人信服的结果。另一种表达40 kDa磷酸盐转运蛋白（PstS-3）和分枝菌酸转移酶Ag85A也被证明可增强免疫性和保护效果。
由于DNA疫苗初始免疫即能诱导应答，因此其在初免—加强免疫策略方面前景广阔。Ag85抗原复免，其脾细胞产生IL-2及IFN-γ的量可增加2～4倍。蛋白抗原加强免疫增强结核菌静脉感染的保护力，揭示了MHCⅡ限制性Th1型CD4+辅助性T细胞在介导免疫保护方面的重要作用。重组的水痘病毒也被用作加强免疫，但发挥作用的是MHCⅠ类CD8+ T细胞。痘病毒应用广泛，在人类使用证明是非常安全的。与表达单个抗原的DNA疫苗相比，重组病毒或细菌疫苗的缺点是不能有很好的加强免疫效果。表达Ag85A的重组修饰的安卡拉豆苗病毒（recombinant modified vaccinia Ankara，MVA）抵抗结核菌免疫的效果与BCG相当。尽管结果十分诱人，但对实验的结果必须谨慎，因为这些结论是在免疫后不久进行的实验得出的。
本研究在总结以前一些学者对于构建的表达结核菌Ag85B的DNA疫苗具备较好的刺激机体产生细胞免疫应答的能力，而且一致公认该抗原具有免疫保护作用的基础上，构建与GST的融合蛋白，主要目的是利用融合蛋白的分子变大，结果稳定，有利于抗原刺激机体免疫系统的原理，构建免疫效果优于单蛋白免疫效果的DNA疫苗。
构建的DNA疫苗pVS85BG及表达hIL-2信号肽的质粒pIL2S经过菌斑筛选，抗生素抗性筛选、限制性内切酶鉴定及基因测序证明，构建的DNA疫苗及pIL2S质粒的基因序列与文献报道的一致，符合设计要求（图1和图2）。
pVS85BG免疫小鼠后，其脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-2、mIFN-γ分别为(339.9±59.4)pg/ml和(432.1±74.4)pg/ml，显著高于pVAX1、pIL2S和PBS对照组（P<0.001），与BCG免疫对照组差异均无显著性。实验组和对照组脾淋巴细胞培养上清的平均mIL-6和mIL-10浓度，每组之间差异均无显著性（P＞0.05，见表1）。表明我们构建的DNA疫苗pVS85BG可刺激机体产生Th1型免疫应答。
pVS85BG免疫C57BL/6小鼠组的脾、肝及肺的平均结核菌量分别为(32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g和(31741.7±7293.7)CFU/g，分别低于pVAX1、pIL2S和PBS等阴性对照组的相应器官的结核菌载量，差异有显著性（P<0.001，见表2）。与BCG免疫小鼠的结核菌量比较，3个器官的平均细菌量的差异仍有显著性。揭示本研究中构建的DNA疫苗pVS85BGG免疫的小鼠具有抵抗标准结核菌株H37Rv经静脉攻击的能力，免疫保护作用显著。
表2同时也显示pVS85BG的免疫保护作用与BCG的免疫保护作用差异还是有显著性（表2及表3）。从免疫程序分析，DNA疫苗需免疫3次，而BCG只需免疫1次。尽管DNA疫苗和BCG均可在哺乳动物体内复制，但是DNA疫苗表达的只是单个的抗原，而BCG的菌体抗原和分泌抗原种类和表达量较DNA疫苗要多得多，这可能是目前研制出的结核DNA疫苗无法与BCG的免疫效果相当或是更优的原因。
本研究的结果表明，pVS85BG具有刺激机体产生的抗结核菌免疫所需的Th1型免疫应答的能力。小鼠经该疫苗免疫后，抵抗结核菌H37Rv攻击的能力比对照组显著增强。尽管此疫苗的免疫保护效果与BCG比较尚有差距，但对其进行联合免疫等方面进行深入研究是必要并且具有潜力的。
【参考文献】（略）
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