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作者：朱中元1，刘建兵１，王海波１，谢 勇１，张春发２，张 颖
【摘要】 目的 评价构建的结核DNA疫苗pVS85BG免疫的小鼠体外产生细胞因子和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的能力。方法 利用基因操作技术将结核菌Ag85B基因和谷胱甘肽S转移酶基因插入pVAX1载体构建表达结核菌Ag85B和GST融合蛋白的DNA疫苗pVS85BG。将雌性C57BL/6小鼠分成5组，每组20只，分别用pVS85BG、pVAX1、pIL2S和PBS分别免疫，以相同的剂量加强免疫2次，均间隔2周。另一组用BCG(105CFU)皮内注射免疫1次。每组的10只鼠在最后一次加强免疫后，无菌取脾培养，上清供检测细胞因子用。另外10只小鼠则用结核菌H37Rv经静脉攻击，于2周后取脾、肝和肺进行培养结核菌并进行菌落计数。结果 pVS85BG免疫组的鼠脾淋巴细胞的培养上清中的mIL-2和mIFN-γ的平均含量分别为(339.9±59.4)pg/ml和(432.1±74.4)pg/ml，显著高于3个阴性对照组（P<0.001），与BCG免疫组差异无显著性(P＞0.05)。5个组的平均mIL-6和mIL-10差异无显著性。pVS85BG免疫组小鼠的脾、肝和肺的平均结核菌菌落数分别为(32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g和(31741.7±7293.7)CFU/g，分别低于pVAX1、pIL2S和PBS等3个阴性对照组的相应器官的结核菌载量（P<0.001），同时也显著高于BCG免疫对照组。结论 构建的DNA疫苗pVS85BG能够刺激机体产生抗结核菌所需的Th1型免疫应答，免疫鼠抵抗H37Rv攻击的能力显著增强。
【关键词】 结核； DNA疫苗； 细胞因子； 免疫保护
【Abstract】 Objective To evaluate the ability to produce cytokines in vitro and the protective efficacy of the mice immunized by the TB DNA vaccine pVS85BG we constructed.Methods Plasmid pVS85BG expressing fusion protein of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and glutathione S-transferase were constructed by inserting ag85b and gst into the vector pVAX1. 20 female C57BL/6 in bred mice in 5 groups immunized with the 100μg pVS85BG， pIL2S， pVAX1， PBS and BCG(105 CFU) for 3 times with 2 weeks interval except BCG(only one injection without boost). Sera and supernatants of 10 mice in each group were determined for hIL-2， mIL-2， mIFN-γ， mIL-6 and mIL-10 by sandwich ELISA. The other 10 mice in each group were challenged by 106 CFUs M tuberculosis H37Rv and killed for culturing H37Rv from the spleens， lungs and livers.Results The average concentrations of mIL-2 and mIFN-γ in the supernatants from pVS85BG immunized mice were (339.9±59.4)pg/ml and (432.1±74.4)pg/ml， significantly higher than those from the pVAX1， pIL2S， and PBS injected controls (P<0.001). No significantly difference has been observed for the mIL-6 and mIL-10 concentrations from the mice in all 5 groups. The average M tuberculosis loads in the spleens， livers and lungs in the pVS85BG immunized group were (32954.2±4457.5)CFU/g，(32748.0±3634.4)CFU/g and (31741.7±7293.7)CFU/g respectively. The average bacterial loads of the 3 organs in the pVS85BG immunized group were significantly lower than those of their counterparts in pVAX1， pIL2S and PBS injected groups， but they were significantly higher than those of their counterparts in the BCG immunized controls.Conclusion TB DNA vaccine pVS85BG we constructed can induce Th1 immune response which is necessary for prevention against TB， and it has the ability to enhance protective immunity to H37Rv challenge in the immunized mice.
【Key words】 Mycobacterium tuberculosis； TB DNA vaccine； cytokines； immune protection
有效控制结核病的流行，除了政府重视，加强健康教育，采取一般性的预防措施和即时发现并治愈痰涂阳性肺结核病人以外，有效预防结核病的疫苗的普遍接种是关键［1］。大量实践证明，BCG对控制原发结核、降低粟粒性结核和结核性脑膜炎的发病率是肯定的。近十几年，世界各地进行了8次BCG现场试验，结果是矛盾的。在欧洲、加拿大和美国部分地区进行的试验保护率较高，总发病率下降70%～80%。但在美国南方和南印度的结果相反，保护效果很差［2，3］。因此，寻求安全、稳定、效果更好的结核疫苗一直是结核病和疫苗专家工作的重点。本研究利用基因操作技术，将具有免疫保护作用的蛋白Ag85B(antigen 85B)和具有使表达合蛋白稳定的谷胱甘肽-S转移酶（glutathione S-transferase， GST）的基因连接，插入美国FDA推荐可用于人体的表达载体pVAX1中，构建表达结核菌保护抗原Ag85B与GST的融合蛋白的真核表达载体。提取并纯化该质粒后，免疫纯系近交系C57BL/6小鼠，免疫小鼠抵抗经静脉注射结核菌H37Rv攻击的能力显著增强。报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 结核菌H37Rv标准株（ATCC27294） 由武汉大学医学院免疫学系刘君炎教授赠送。其毒力通过定期小鼠体内传种维持。结核菌传种在改良罗氏(Lowenstein-Jensen Medium，L-J)培养基进行。
1.1.2 pVAX1真核表达载体 美国Invitrogen公司产品，由美国国立卫生研究院张颖研究员提供。其基因序列及多克隆位点见该公司网站资料［4］。
1.1.3 Gex-2T载体 大连宝生物公司提供。
1.1.4 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）DH5α及JM109菌株 华南热带农业大学生物中心保存菌株。
1.1.5 Ex Taq DNA酶，LA Taq DNA多聚酶，10×PCR缓冲液，dNTPs，限制内切酶Xba I，Hind Ⅲ，Pme I，Not I，Nhe I等 均由大连宝生物公司提供。
1.1.6 PCR试剂等 PCR 产物回收试剂盒，DNA连接试剂盒，λ-Hind Ⅲ DNA Marker，DNA Marker DL2000等均为大连宝生物公司提供。
1.1.7 BCG 上海生物制品研究所生产。
1.1.8 C57BL/6小鼠 购自北京维通利华实验动物公司。均为雌性，购买时6～8周龄，初次免疫时8～10周龄。动物在实验期间，饲养在无特殊病原体条件。该公司提供的C57BL/6小鼠的核心种群来源于Charles River Laboratories（Wilmington，Mass，USA）。
1.1.9 hIL-2、鼠白细胞介素-2（murine interleukin-2，mIL-2）、鼠干扰素γ（murine Interferon γ，mIFN-γ）、鼠白细胞介素-6（mIL-6）和鼠白细胞介素-10（mIL-10）ELISA法定量测定试剂盒 法国Diaclone Research公司（1， bd A. Fleming， 25000 BESANCON， France）产品。
1.1.10 胎牛血清（FCS） 为广州暨南大学生物技术研究所提供进口分装胎牛血清。
1.1.11 RPMI 1640培养基 Gibco公司产品。RPMI1640完全培养基的配制：临用前，10ml FCS与90ml RPMI培养液混合即可。
1.1.12 酶免疫读数仪 芬兰Labsystem公司生产的Wellscan MKⅡ型。
1.2 方法
1.2.1 结核菌基因组DNA的提取 见文献［5］。
1.2.2 表达载体的构建过程 见图1。
(1)根据实验需要设计合成下列引物。GST-P7：5′-AGT TCT AGA GCC GCC GCC ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TG-3′(41Mer)。除下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点外，其余部分均同GST-P5。GST-P8：5′-A GCT TTG TTT AAA CTA GTC AGT CAC GAT GCG GCC GCT-3′(37 Mer)。下划线部分为Pme Ⅰ酶切位点。Ag85B-P5： 5′-TCA TAT AAG CTT AGC GGC CGC GCC GCC GCC ATG ACC GCG GGC GCG TTC TCC-3′（51Mer）。下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点。双下划线部分为Not I酶切位点。斜体部分为Kozak序列。添加有起始密码子ATG。Ag85B-P6： 5′-GAT TCT AGA TCA GCC GGC GCC TAA CGA ACT CTG C-3′（34 Mer）。下划线部分为Xba Ⅰ酶切位点。斜体下划线部分为终止密码子。引物Ag85B-P5和Ag85B-P6分别为结核菌Ag85B基因［6，7］（Ag85B，也称MT85B， fibronectin binding secreting protein， Genbank Accession Number： X62398）的109-126位和958-978位碱基序列，扩增物长度约为900bp。表达产物为Ag85B成熟蛋白。Ag85B-F：5′-AAT GAT CTT GGC CGC CTA CC-3′(20 Mer)。为Ag85B基因516-535位DNA片段与Ag85B-F引物序列完全互补。为测序引物。(2)将TB-V7［8］质粒用Xba I和Hind III双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的p-IL2S-2。(3)以TB-V2［8］质粒为模板，Ag85B-P5/ Ag85B-P6为引物，使用PyrobestTM DNA Polymerase PCR扩增目的片段Ag85B DNA。(4)将PCR扩增片段Ag85B DNA用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收。将回收后的片段用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收Ag85B DNA 片段a。(5)使用 DNA Ligation Kit中的Solution Ⅰ，将Ag85B DNA片段a和p-IL2S-2 DNA在16℃水浴中进行连接，热转化至E.coli Competent Cells DH5α中，涂布平板，过夜培养菌体。(6)挑选阳性菌落。培养增殖细菌，提取质粒，质粒命名为TB-V7-2。(7)将TB-V7-2质粒使用Xba I和Hind Ⅲ进行双酶切鉴定。(8)将TB-V7质粒分别使用T7 Promoter/pcDNA3.1R引物进行测序。测序结果均与参考序列一致。(9)将TB-V7-2质粒用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收目的TB-V7-2 DNA。(10)以TB-V5［8］质粒为模板，GST-P7/GST-P8为引物，使用 PyrobestTM DNA Polymerase PCR扩增目的片段GST DNA。(11)将PCR扩增片段GST DNA用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收。将回收后的片段用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ双酶切，使用 PCR Fragment Recovery Kit切胶回收GST DNA片段b。(12)使用DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，将GST DNA片段b和TB-V7-2 DNA在16℃水浴中进行连接，热转化至E. coli Competent Cells DH5α中，涂布平板，过夜培养菌体。(13)挑选阳性菌落。培养增殖细菌，提取质粒，命名为pVS85BG。(14)pVS85BG质粒使用Xba Ⅰ和Pme Ⅰ进行双酶切鉴定。(15) pVS85BG质粒分别使用Ag85B-F/pcDNA3.1R引物进行测序。
图1 pVS85BG疫苗的构建及酶切位点示意图
1.2.3 质粒DNA的提取及纯化 见文献［5，9］。
1.2.4 C57BL/6的免疫程序 共分pVS85BG免疫组、pVAX1注射组、pIL2S［8］注射组、PBS对照组及BCG对照组，共5组，每组20只，其中10只小鼠用于脾淋巴细胞体外产生细胞因子试验，余下的10只用于观察疫苗免疫小鼠抵抗H37Rv攻击的试验。免疫方法：将各种抗结核DNA疫苗浓缩制剂用pH 7.2的无热源0.1M PBS稀释至1000μg/ml，取0.1ml分四点注射入每只小鼠腿部肌肉内，pVS85BG免疫组、pVAX1注射组、pIL2S注射组、PBS对照组，分别在0、15和30天分别免疫或者注射1次，共3次。BCG按要求皮内注射免疫，每只小鼠105个CFU。只免疫1次。
1.2.5 小鼠脾淋巴细胞的培养及上清收集 免疫组小鼠和各对照组小鼠经挑除眼球收集血清后断颈处死，用75%酒精消毒皮毛，无菌操作取脾称重，去筋膜，研磨成匀浆，加适量不完全RPMI 1640，纱网过滤，计数淋巴细胞数目，用RPMI 1640完全培养基配制成106/ml，接种于24孔培养板，5%CO2环境37℃培养72h，收集培养液，离心取上清-20℃保存待检。
1.2.6 细胞因子的定量测定 以生物素-亲和素双抗体夹心法定量检测mIFN-γ为例。(1)将小鼠脾淋巴细胞培养上清、标准品（mIFN-γ： 1000pg/ml倍比稀释至31.25pg/ml）、标准品稀释液（作空白对照用）和质控品复溶液各100μL加入微孔内，均作复孔。(2)将生物素标记的抗mIFN-γ抗体用稀释液1：27.5稀释，每孔加50μl，微型混合器混匀。(3)置37℃恒温箱1h后，甩干液体，每孔加300μl洗涤液浸洗1min，共洗涤3次。(4)将工作浓度的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μl加入各孔（含空白孔），37℃放置30min。(5)同前洗涤后，每孔加入100μl TMB底物避光反应15min。(6）各孔加入100μl 2M H2SO4终止反应，立即用酶免疫读数仪测OD450。（7）标准曲线完成后，将各标本复孔OD的均数代入方程求得mIFN-γ的含量。hIL-2、mIL-2、mIL-6和mIL-10的测定的基本过程同mIFN-γ的测定。
1.2.7 H37Rv感染C57BL/6小鼠 根据文献［10，11］改进。简要步骤：将结核菌H37Rv株接种于L-J斜面37℃培养20天，挑取菌落，加少许生理盐水，用组织研磨器制成悬液，与麦氏比浊管进行比色，配制成2mg/ml，冻存于-20℃。取0.1ml接种L-J斜面，共接种3管，培养20～30天，计数CFU。根据CFU计数结果，用无热源及无菌生理盐水将H37Rv菌配制成107CFU/ml，每只小鼠尾静脉注射0.1ml（106个结核菌）感染小鼠。
1.2.8 感染鼠组织器官的结核菌培养及计数 小鼠感染结核菌后喂养15天后杀鼠，无菌取出肝、肺和脾，称重、制备成匀浆。分别取原液、1：10和1：100稀释液各0.1ml接种于L-J培养基斜面，每只鼠的每个器官的每种浓度各接种3管，37℃培养20～30天后，观察并计数L-J斜面培养基上的结核菌菌落数。计算公式如下。
S（CFU）=C×(O+V)/O×10×相应管的稀释倍数
C：3个L-J培养管出现的菌落数的均数。如果为原液接种的3管的均数，则稀释倍数为1；如果为1：10稀释管的均数，则稀释倍数为10；如果为1：100稀释管的均数，则稀释倍数为100。
10：接种量为0.1ml，相当于1/10g，为常数。乘以10为每g器官里的结核菌数。
O：为器官的重量（g）。
V：为加入生理盐水的体积。1ml=1g。
S：为每只鼠的结核菌个数，单位为CFU/g。
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